創(chuàng)新藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)

目前FDA批準(zhǔn)的藥物所針對的靶點(diǎn)僅有約800個，存在大量已知疾病相關(guān)靶點(diǎn)“無藥可及”。“無藥可及”靶點(diǎn)指的是通過傳統(tǒng)手段難以靶向而又極具臨床意義的治療靶點(diǎn)，隨著基礎(chǔ)研究和新技術(shù)的進(jìn)步，SHP2和KRAS等這些傳統(tǒng)意義上被認(rèn)為是“不可成藥”的靶點(diǎn)正在不斷被攻克，甚至日漸發(fā)展成為當(dāng)下zui熱門的靶點(diǎn)。

從大規(guī)模小分子庫出發(fā)，通過各種不同的篩選技術(shù)平臺，針對感興趣蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)，是 “first-in-class”類藥物研發(fā)的主要策略之一。但目前，大多數(shù)的藥物篩選技術(shù)都是以純蛋白作為實(shí)驗(yàn)體系。靶點(diǎn)蛋白質(zhì)在表達(dá)純化過程中會遇到很多問題，比如表達(dá)體系不好選擇，純度難以提高，結(jié)構(gòu)和活性難以保持等，這些挑戰(zhàn)對于膜蛋白相關(guān)靶點(diǎn)尤其突出。因此，第一步靶標(biāo)蛋白的純化和制備經(jīng)常成為了藥物發(fā)現(xiàn)的“卡脖子”環(huán)節(jié)。

化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的問世革命性地將藥物發(fā)現(xiàn)從純蛋白體系帶入了活細(xì)胞體系。以共價(jià)藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)為例，從結(jié)構(gòu)多樣的分子庫出發(fā)，在活細(xì)胞水平給予小分子處理，確保蛋白質(zhì)均處于自然活性狀態(tài)，之后借助于生物活性探針，利用基于活性的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)（activity-based protein profiling，ABPP）捕捉分析每個小分子與靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，構(gòu)建小分子與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。

創(chuàng)新藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)   

蛋白質(zhì)組分析助力靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn) 

技術(shù)簡介

通過對生物樣品進(jìn)行全蛋白質(zhì)組的提取，酶解，肽段分級，高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和搜庫檢索，可以同時對樣品中成千上萬個蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的定性和定量分析。疾病與健康狀態(tài)下或藥物處理前后，比較細(xì)胞或組織樣本中蛋白質(zhì)的種類和豐度差異，從而尋找藥物作用的靶標(biāo)。提供標(biāo)準(zhǔn)化的樣品處理方案、蛋白質(zhì)組定性定量鑒定和zhuanye的數(shù)據(jù)分析策略。

蛋白質(zhì)組定量分析技術(shù)：

非標(biāo)記定量技術(shù)（LFQ）：

技術(shù)： 通過比較譜圖數(shù)目或離子峰面積，分析不同樣品的蛋白含量 優(yōu)勢： 無需同位素標(biāo)記，快速比較大量樣本間的蛋白質(zhì)豐度差異 應(yīng)用： 細(xì)胞、組織、血液等樣本

還原二甲基化標(biāo)記定量技術(shù)（REDI）：

技術(shù)： 利用同位素標(biāo)簽與肽段賴氨酸側(cè)鏈與N端的氨基反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)二重或三重樣本間的蛋白定量比較 優(yōu)勢： 經(jīng)濟(jì)便捷，普適性強(qiáng) 應(yīng)用： 細(xì)胞、組織、血液等樣本

穩(wěn)定同位素氨基酸代謝標(biāo)記定量技術(shù)（ SILAC）：

技術(shù)： 利用含穩(wěn)定同位素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)不同樣本間的蛋白質(zhì)組定量 優(yōu)勢： 操作誤差影響少，定量更精準(zhǔn) 應(yīng)用： 活細(xì)胞樣本

串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記定量技術(shù)（TMT/IBT）：

技術(shù)： 利用TMT/IBT試劑標(biāo)記肽段，檢測樣品中報(bào)告基團(tuán)的信號強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)不同樣本中的蛋白定量比較 優(yōu)勢： zui高可達(dá)16重樣本分析，定量準(zhǔn)確 應(yīng)用： 細(xì)胞、組織、血液等樣本

服務(wù)內(nèi)容

1.疾病、藥物處理和環(huán)境刺激等條件引起的 全蛋白質(zhì)組差異蛋白定量分析

2.亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體等） 全蛋白質(zhì)組定量分析

3.全蛋白質(zhì)組水平生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

非共價(jià)藥物作用靶點(diǎn)的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析

活性小分子在發(fā)揮生物學(xué)功能時，若與靶點(diǎn)蛋白間的相互作用為非共價(jià)形式（如氫鍵、堆積），則可將該活性小分子改造具有相似活性的化學(xué)探針，并利用原位快速光交聯(lián)策略，在原生物學(xué)活性環(huán)境中，將非共價(jià)作用轉(zhuǎn)化為共價(jià)相互作用，從蛋白質(zhì)組中直接捕獲活性分子的作用靶點(diǎn)，為揭示活性小分子的作用機(jī)制提供更詳細(xì)的信息。 該方法適用于活細(xì)胞、組織、細(xì)胞裂解液等多種樣本體系，活性小分子包括但不限于內(nèi)源性代謝物、中藥活性成分、天然產(chǎn)物、非共價(jià)藥物等。

服務(wù)內(nèi)容

非共價(jià)藥物分子探針的設(shè)計(jì)與改造

非共價(jià)藥物分子靶點(diǎn)蛋白的組學(xué)分析（基于凝膠成像與生物大分子質(zhì)譜）

非共價(jià)藥物作用位點(diǎn)解析（基于質(zhì)譜）

非共價(jià)藥物作用靶點(diǎn)驗(yàn)證（靶向定量蛋白質(zhì)分析/蛋白免疫印跡法）

 共價(jià)藥物作用靶點(diǎn)的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析

在細(xì)胞或組織中，對共價(jià)藥物進(jìn)行靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)時，可對該活性小分子進(jìn)行簡單的化學(xué)改造，連接報(bào)告基團(tuán)（生物素、生物正交基團(tuán)等）。 在保留小分子原有活性的前提下，在活細(xì)胞或組織中直接捕獲與之作用的蛋白靶點(diǎn)，通過富集、酶解、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)分析，獲得靶點(diǎn)的組學(xué)信息與小分子作用的氨基酸位點(diǎn)信息。

然而很多活性分子不易改造，或與氨基酸殘基反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定而不適用于質(zhì)譜檢測，因此，針對這類活性分子，競爭性位點(diǎn)鑒定是很好的解決策略。 該方法的核心技術(shù)是一種通用型化學(xué)探針，當(dāng)活性小分子與氨基酸殘基反應(yīng)而占據(jù)該位點(diǎn)時，與空白對照樣本相比，通用型化學(xué)探針對該位點(diǎn)的標(biāo)記便產(chǎn)生信號差異，對這部分標(biāo)記信號差異進(jìn)行讀取，獲得活性分子的靶點(diǎn)蛋白和氨基酸位點(diǎn)信息，可同時包括on-target/off-target信息。 該方法適用于活細(xì)胞、組織、細(xì)胞裂解液等多種樣本體系， 活性小分子包括但不限于內(nèi)源性代謝物、中藥活性成分、天然產(chǎn)物、共價(jià)藥物等。

服務(wù)內(nèi)容

共價(jià)藥物探針設(shè)計(jì)與改造

共價(jià)藥物靶點(diǎn)蛋白的組學(xué)分析（基于凝膠成像與生物大分子質(zhì)譜）

共價(jià)藥物作用位點(diǎn)解析（基于質(zhì)譜）

共價(jià)藥物作用靶點(diǎn)驗(yàn)證（靶向定量蛋白質(zhì)分析/蛋白免疫印跡法）

共價(jià)藥物先導(dǎo)化合物篩選

 PROTAC蛋白靶點(diǎn)與降解圖譜分析

在全蛋白質(zhì)組水平檢測PROTAC分子on target/off target，是該類藥物開發(fā)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Proteolysis Targeting Chimeric (PROTAC)技術(shù)核心是發(fā)展能與靶蛋白結(jié)合并招募降解酶的雙功能分子，利用該分子招募泛素化酶靠近靶蛋白，從而使其泛素化降解，該技術(shù)可用于治療多種疾病。  

服務(wù)內(nèi)容

PROTAC在全蛋白質(zhì)組層面的降解圖譜（基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量鑒定）

蛋白靶點(diǎn)的降解驗(yàn)證（靶向定量蛋白質(zhì)分析/蛋白免疫印跡法）

 非共價(jià)藥物結(jié)合口袋鑒定

在小分子藥物開發(fā)過程中，確定藥物與靶點(diǎn)蛋白之間的結(jié)合方式至關(guān)重要，一方面有助于理解藥物作用機(jī)制，另一方面為其后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，包括X-ray, cryo-EM, NMR等，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于藥物結(jié)合模型確定中，尤其是高分辨率的藥物-蛋白共晶結(jié)構(gòu)，能夠極大的幫助藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化。然而，一直以來，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析都是生命科學(xué)研究中的挑戰(zhàn)性任務(wù)，尤其是GPCR，離子通道等膜蛋白靶點(diǎn)。通常，為了得到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)純化，人工篩選藥物和蛋白結(jié)晶條件，晶體數(shù)據(jù)采集和解析等過程，需要大量的時間和成本投入。

在細(xì)胞水平，確定藥物和靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的直接作用方式，是藥物開發(fā)者夢寐以求的事情，避免了蛋白質(zhì)在純化過程中結(jié)構(gòu)的丟失以及人工篩選的緩沖體系和高濃度藥物-蛋白條件帶來的假陽性。

流程圖

如圖所示，其原理是利用具有生物活性的光親和化學(xué)探針（與藥物分子活性類似），在藥物正常使用濃度下，與疾病相關(guān)細(xì)胞或組織孵育，原位快速光交聯(lián)即可將藥物分子探針與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)之間的非共價(jià)作用轉(zhuǎn)化為共價(jià)作用，經(jīng)過靶點(diǎn)蛋白質(zhì)富集，酶切釋放非修飾肽段，選擇性富集藥物分子探針修飾肽段，借助于高分辨生物大分子質(zhì)譜，即可快速確定肽段信息。

由于化學(xué)探針僅能與空間臨近的肽段，即結(jié)合口袋附近的肽段發(fā)生原位交聯(lián)，因此，通過該肽段信息不僅能夠確定靶點(diǎn)信息，同時能夠獲得藥物結(jié)合口袋信息，再借助于分子對接，能夠快速得到藥物與靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)合模型，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與使用。